پنه‌لوپه کروز در شهر الکوبنداز واقع در بخش خودمختار مادرید در اسپانیا از یک خانوادهٔ مسیحی کاتولیک به‌دنیا آمد. پدر وی، ادواردو کروز، گاراژدار، فروشنده و تعمیرکار خودرو و مادرش، انکارنا سانچز آرایشگر بود.
پنه‌لوپه دوران کودکی خود را در الکوبنداز —شهری کارگری در حومهٔ مادرید— گذراند. او همچنین اوقات بسیاری را در خانهٔ مادربزرگش سپری کرد. او فرزند بزرگ خانواده‌اش بود، خواهر وی مونیکا کروز، رقصنده و ستارهٔ سینما و برادرش ادواردو کروز، خواننده اسپانیایی‌زبان است. پنه‌لوپه دوران کودکی‌اش را دوران خوبی می‌داند، هرچند چارلی رز دوران کودکی او را معمولی توصیف کرده‌است. پنه‌لوپه به‌یاد می‌آورد که در چهارسالگی، هنگام بازی با دوستانش، خود را شخصِ دیگری می‌پنداشت و به‌جای آن، نقش بازی می‌کرد. وی همچنین از دوران کودکی خود نقل می‌کند که به‌هنگام دست نیافتن به خواسته‌اش، بر زمین دراز کشیده و شروع به لگد زدن و شکاندن وسایل می‌کرده‌است.
در کودکی، پنه‌لوپه در آرزوی هنرپیشگی نبود بلکه بیشتر خواهان رقصنده شدن بود. شور وی به رقصیدن، بالاخره به ورودش به هنرکدهٔ ملی هنرهای زیبای اسپانیا انجامید. کروز به مدت ۹ سال در آنجا به آموختن باله کلاسیک مشغول بود. پنه پس از آن به‌مدت سه سال با آنجلا گاریدو، آموزش بالهٔ اسپانیایی دید؛ سپس برای چهار سال در آموزشگاه کریستینا روتا در نیویورک، با آموزگاریِ رائول کابالِرو، رقص جاز آموخت.
پنه‌لوپه در نوجوانی، با دیدن فیلم Tie Me Up! Tie Me Down! به کارگردانیِ پدرو آلمودوار به هنرپیشگی دلبست. او در آزمون‌های هنرپیشگی نیز شرکت جست ولی فردِ استعدادیاب، به‌دلیل اینکه حس کرد وی هنوز جوان است، پنه‌لوپه را نپذیرفت.
پس از آن مدل مجله‌های گوناگون شد. کار بازیگری را نخست با مجموعه رز در کانال FR۳ تلویزیون فرانسه آغاز کرد و نخستین کارش در سینما همه چیز درباره مادرم به کارگردانی پدرو آلمودووار است. در سال ۲۰۰۱ در فیلم آسمان وانیلی و بدنبال آن در چشمانت را بگشا بازی کرد. در ۲۲ فوریه ۲۰۰۹ برای بازی در ویکی کریستینا بارسلونا برنده جایزه اسکار بهترین بازیگر نقش مکمل شد. او در قسمت چهارم فیلم سینمایی دزدان دریایی کارائیب هم ایفای نقش کرده‌است.